简介原核抒发系统是基因工程中诈骗最早，最历害，效用很高的经典抒发系统。常用的是大肠杆菌抒发体系裸舞，具有培养浅易，周期短，资本低，抒发水平高级秉性。大肠杆菌体系卵白抒发的主要经由为：PCR扩增主张片断——将基因片断克隆到抒发载体上——调换抒发宿主菌——优化提醒抒发主张卵白——纯化主张卵白

管理决策1、查找主张基因序列由于引物是凭证主张基因序列来联想的，是以查找到主张基因序列是联想引物的第一步。查找主张基因序列不错在多个网站上查到，也不错在文件中查找。这里先容的是相比常用的NCBI网站查找基因序列的递次。NCBI是好意思国国度生物本事信息中心，网站上具有多个生物数据库，是生物学探讨常用的网站。

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1.1掀开NCBI网站，鄙人拉框遴荐Gene，输入主张卵白称号；（这里以p65为例） 裸舞

1.2 找到对应物种，也不错遴荐右侧框中的物种查找； 

1.3 页面往下拉，找到mRNA and Protein(s)，遴荐正确的isoform，NMxxx示意mRNA序列，NPxxx示意卵白质序列； 

1.4 新页面往下拉，点击CDS，点击右侧FASTA，即可得到主张基因的mRNA序列，复制粘贴到新的文本，以备使用。 

2、遴荐合适的抒发载体常用的原核抒发载体有pET15b，pET28a，pGEX4T1，pGEX-6p-1等。抒发载体一般包括启动子，多克隆位点，抗性基因，标签基因等等。抒发载体的遴荐原则：1）启动子是否为原核启动子；2）标签基因是否是咱们需要用的标签。常用的标签的标签有His，GST，MBP，Strep，Flag标签等，标签遴荐如下： 

3、联想引物联想引物也有多个软件不错使用，这里先容的是常用的Primer 5软件。联想引物的基本原则是：1）引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不可大于38bp；2）引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，高卑劣引物GC含量和Tm值要保捏接近；3）引物所对应的模板序列的Tm值最佳在72℃傍边；4）3'端最佳不若是连气儿碱基，GGG或CCC会导致失实的激勉，同期3'端终末一个碱基最佳不若是A或T，不然容易导致错配；5）以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5算计Tm值，也即是退火温度。遴荐较低Tm值的引物的退火温度为反映的退火温度，最佳保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃规模内；6）在DNA测序和PCR中最佳用5'末端显露（GC含量多），而3'端不显露（AT含量多）的引物，这种引物的结构不错灵验地摈斥假激勉反映；7）引物和产物之间的Tm值相离别太大，20摄氏度规模内最佳。

此外，在引物的两头需要加上酶切位点和保护碱基。为了保证基因序列的标的性，况兼驻防自连，当今基本上都遴荐双酶切位点。酶切位点的遴荐原则：1）酶切位点存在于载体上，不存在于基因序列中；2）两个酶最佳有共同的缓冲体系；3）两个酶在载体上酶切位点位置不可太近。如果载体上莫得标签序列，还需要在引物联想时加上标签序列。

若何详情酶切位点3.1  掀开Primer 5，遴荐file - new -DNAsequence，输入上述保存的CDS序列，点击As Is； 3.2  点击左侧Enzyme框，看一下载体上遴荐的双酶切位点是否在右侧框中，如果不在，从左侧框中添加到右侧框中； 3.3  点击OK即可查抄CDS序列中有无采用的酶切位点，如果采用的双酶切位点存在于主张卵白的CDS序列中，需再行遴荐双酶切位点。 

若何联想引物3.4 掀开Prime 5软件，点击File——New——DNA Sequence 3.5 点击空缺处粘贴咱们之前找好的主张基因的CDS序列，遴荐As is。 3.6  点击左上角的Primer，S为正向引物，A为反向引物  3.7  点击Edit Primers裁剪序列，可诊疗引物口角，添加酶切位点序列以及保护碱基。如果浮现Hairpin，Dimer，False Priming，Cross Dimer大约Tm值太高或太低，则需要诊疗。 

如果检测引物特异性3.8  NCBI主页最下端找到Primer-BLAST，掀开； 3.9  输入高卑劣引物序列，点击最下方  ； 3.10  如果只可检测到你的主张卵白基因，则标明特异性较好。

拿到合成的引物之后，咱们就不错进行主张基因的扩增了。合成主张基因时常是以盘算物种的基因组为模板。由于真核生物的基因组中存在内含子序列，在mRNA的剪接加工过程中被切除，因此，在构建真核基因克隆时基因组DNA不可径直用作PCR扩增的模板，只可从细胞大约组织中索求总RNA大约mRNA，回转录cDNA动作模板通过PCR扩增主张基因。

4、从细胞中索求总RNA4.1  从细胞培养箱中取出一经长满细胞的细胞培养皿，防止吸出培养基，加入4ml预冷PBS，歪斜细胞培养皿3次以充分洗涤细胞，然后防止吸尽PBS溶液。4.2  培养皿中加入1ml Trizol试剂裂解细胞，冰上静置5min，枪头奏乐，室温静置5min；4.3  将细胞裂解液吸到1.5ml EP管中，加入CHCl₃ 0.2 ml，轰动仪轰动15s。4.4  室温静置2-3min，12000xg，4℃，15min离心。4.5  离心后液体分为三层（表层无色为RNA，中层为DNA，底层为卵白质），防止吸取表层无色液体至新的EP管中。4.6  加入等体积异丙醇，混匀，冰上静置10min，12000xg，4℃，10min离心。4.7  此时在管底可见RNA白色千里淀，弃去上清。4.8  加入75%酒精1ml，轰动仪轰动30s，7500xg，4℃，5min离心。4.9  防止去上清，管内千里淀在超净台中饱读风静置干燥3-5min。4.10  加入20ul DEPC水溶解。水浴大约加热器55-60℃，10-15min。4.11  测定纯度和浓度。吸光度A260/280比值接近2标明纯度较高。部分有关产物

货号 称号 规格 用途 abs9331 RNA索求试剂盒 100ml RNA索求试剂盒 25050070 Amersham RNAspin Mini Kit 20T RNA索求试剂盒

 

5、回转录取得cDNA回转录时常使用试剂盒和PCR仪器进行操作，这里参照了爱必信的RT-PCR Kit产物施展书进行先容。产物组分： 试验递次：5.1  将 RNA 模板、引物、2×One-Step RT-PCR SuperMix，RT Enzyme Mix 和RNase Free Water 溶解并置于冰上备用。5.2  成就以下反映体系： 5.3  轻轻混匀后一会儿离心，使管壁上的溶液收罗到管底。5.4  常用反映表率： 5.5  反映完成后，测定纯度和浓度。部分有关产物

货号 称号 规格 用途 abs60076 回转录试剂盒 50T 回转录试剂盒 27925901 Amersham Ready-To-Go RT-PCR Beads 0.2ml 回转录试剂盒

6、主张基因的扩增主张基因的扩增时常亦然使用试剂盒和PCR仪器完成。这里参照了爱必信的2xPfu Master Mix产物施展书进行先容。注：统统组分应仔细混匀并离心后开启，统统 PCR操作过程应在冰上进行。操作示例：以50 μl PCR反映体系为例 。6.1  按照下表配制 PCR反映体系 *模板量：1-2 μl RT-PCR反映后的 cDNA。6.2  PCR反映轮回的设备 6.3  终端检测：取 2-5 μl反映液电泳不雅察终端，测定纯度和浓度。

主张基因扩增之后，就要将主张基因和抒发载体聚会在整个。时常使用酶切聚会的递次，将主张基因和抒发载体分袂用相似的两个甩掉性内切酶进行双酶切，得到互补的酶切位点，然后用T4聚会酶将这两部分聚会在整个。主张基因扩增之后，主张基因存在的缓冲体系可能会影响到酶切终端，是以时常先进行主张基因的纯化，也叫作切胶回收。

部分有关产物

货号 称号 规格 用途 abs60057 2×HotStart Taq PCR Mix 5×1ml 主张片断DNA扩增 abs60055 2×Pfu PCR MasterMix 5×1ml 主张片断DNA扩增

 

7、主张基因的纯化先进行跑胶，然后进行切胶回收。切胶回收时常也使用试剂盒进行操作，这里参照爱必信的DNA Gel/PCR Purification Kit产物施展书进行先容。7.1  取50xTAE缓冲液20ml加水至1000ml，配制成1xTAE电泳缓冲液，备用。7.2  称取0.5g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 1xTAE电泳缓冲液，在微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀。加热过程中要时常摇动，使琼脂糖在溶液中散布均匀。7.3  在制胶槽中插好梳子，向冷却的琼脂糖中加入GelRED染色剂，妥贴倒入制胶槽中。把制胶槽放入电泳仪中，在电泳仪中倒入TAE电泳缓冲液。7.4  将50ul PCR产物中加入10ul 6x loading buffer并混匀，用移液器防止加入到加样孔中。在附近的孔中加入核酸Marker。7.5  加样完成后，盖上电泳仪盖子，启动电源。电压时常设备为100V，当溴酚蓝指令跑到允洽位置时，关闭电源住手电泳。7.6  将凝胶周折至核酸检测仪中，在紫外灯下快速准确的切下含有主张DNA片断的琼脂糖凝胶块，放进1.5ml离心管中。以下为爱必信DNA Gel/PCR Purification Kit产物施展书进行胶回收先容。产物组分： 7.7  DNA吸附柱均衡处理：向Gel Recovery Column中加入200μl buffer CBS，12000rpm离心1min，倒掉收罗管中的废液，将Gel Recovery Column再行放回到收罗管中。再向Gel Recovery Column中加入200μl的ddH2O，12000rpm离心1min，倒掉收罗管中的废液。将Gel Recovery Column再行放回到收罗管中。7.8  从琼脂糖凝胶中切下含有主张片断的凝胶，忖度分量或精准称量分量。每100mg 1%琼脂糖凝胶加入100μl Binding Solution。7.9  于50-60℃水浴5-10min，时间每2-3min隔断微弱荒谬混匀，直至胶块全都熔化。7.10  于50-60℃水浴5-10min，时间每2-3min隔断微弱荒谬混匀，直至胶块全都熔化。7.11  将吸附柱再行放回收罗管中，加入500μl WA Solution，于12000rpm离心1min，倒掉收罗管中废液。7.12  将吸附柱再行放回收罗管中，加入500μl Wash Solution，于12000rpm离心1min，倒掉收罗管中废液。7.13  换取上个法子一次。7.14  将吸附柱再行放回收罗管中，12000rpm离心1min，掀开吸附柱盖子，室温放弃5-10min或50℃放弃3-5min，以澈底去除Wash Solution。7.15  将吸附柱放入干净的1.5ml收罗管中（试剂盒自带），关于膜中央悬空加入30-50μl Elution Buffer，盖好盖子，37℃放弃2min，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为包含主张基因的溶液。7.16  检测纯度及浓度。DNA纯度为 OD260/280的比值为1.8时最理念念，纯度最高，为1.8—2.0都还好。

部分有关产物

货号 称号 规格 用途 abs60098 PCR & DNA Fragment Purification Kit 50T DNA片断胶回收试剂盒 28104 QIAquick PCR Purification Kit 50T DNA片断胶回收试剂盒

 

8、主张基因和抒发载体的双酶切酶切操作淡薄参考购买的甩掉性内切酶的使用施展书，这里先容旧例递次。8.1  在两个PCR管等分袂羼杂以下因素：抒发载体酶切：

抒发载体 2ug 10x缓冲液 5ul 酶1 1ul 酶2 1ul ddH2O 补皆至30ul

PCR产物酶切：

主张片断 43ul 10x缓冲液 5ul 酶1 1ul 酶2 1ul

8.2  轻弹管壁混匀，一会儿离心。8.3  放入PCR仪中，37℃，3h。8.4  跑电泳进行胶回收。

9、主张片断和抒发载体的聚会9.1  取PCR管，加入酶切后的抒发载体片断2ul，酶切后的主张基因片断6ul，T4 DNA聚会酶1ul，10* T4 buffer 1ul，轻弹管壁混匀，一会儿离心。9.2  放入PCR仪中，16℃过夜。部分有关产物

货号 称号 规格 用途 28954549 PGEX-4T-1 25ug 抒发载体 28954648 PGEX-6P-1 VECTOR 25ug 抒发载体 abs60084 T4 DNA Ligase 500U 聚会酶 abs60085 T-Vector快速克隆试剂盒 20T 旧例克隆 abs60089 pBM21快速克隆试剂盒 20T/3×20T 旧例克隆 abs60091 T-Vector pTOPO快速克隆试剂盒 20T/100T TOPO克隆 abs60095 pBM16A Toposmart快速克隆试剂盒 20T/3×20T TOPO克隆 abs9314 核酸预制胶 10片/盒 核酸预制胶 abs60002 DL 2000 DNA Marker 100T(250ul×2支) DNA Marker

10、调换主张基因与载体的聚会反映中，存在多种可能的聚会面目，除了正确聚会外，也可能出现载体和载体聚会，主张基因和主张基因聚会，大约部分聚会的情况，因此需要把正确聚会的重组质粒筛选出来。时常将聚会产物调换到大肠杆菌中，通过菌落PCR大约酶切果决的递次筛选出阳性克隆株，然后送到测序公司进行测序。测序准确的阳性克隆株就不错进行多半扩增和保存。常用的大肠杆菌感受态细胞为DH5α大约TOP十。10.1   取出感受态大肠杆菌，放于冰上使其冉冉熔化。10.2  将聚会产物加入100ul感受态大肠杆菌中，轻轻混匀，冰上孵育30分钟。10.3  将EP管放入42℃水浴箱中热激90秒，再速即放于冰上2分钟。10.4  EP管中加入400u LB培养基，置于摇床上，37℃，500rpm培养45分钟。部分有关产物

货号 称号 规格 用途 abs60101 DH5α 感受态细胞 10×100ul/20×100ul 感受态细胞

 

11、涂板培养500rpm离心1-2分钟，留100ul培养基上清，将调换后的大肠杆菌轻轻混匀，涂于含抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中荒谬培养过夜。

12、挑克隆及阳性克隆株果决挑取3-5个单克隆分袂放入不同的离心管中（如果菌落未几不错全部挑取），此时不错进行菌落PCR和酶切果决。1）菌落PCR同质粒构建时的PCR扩增，使用相似的引物，模板换成挑出的菌落；跑胶如果有扩增的条带则为阳性克隆株；2）酶切果决菌落提质粒，使用质粒构建时的酶进行酶切；跑胶如果看到主张片断则为阳性克隆株；部分有关产物

货号 称号 规格 用途 abs9224 Ampicillin Sodium 5g/25g/100g 氨苄抗生素 abs60057 2×HotStart Taq PCR Mix 5×1ml 主张片断DNA扩增 abs60055 2×Pfu PCR MasterMix 5×1ml 主张片断DNA扩增 abs9314 核酸预制胶 10片/盒 核酸预制胶 abs60002 DL 2000 DNA Marker 100T(250ul×2支) DNA Marker

13、质粒索求酶切果决需要提质粒，如果径直送公司测序，此步也可不祥。索求质粒一般亦然使用试剂盒进行操作，这里参照爱必信的质粒小量快速索求试剂盒产物施展书进行先容。产物组份： 试验递次：13.1  向吸附柱AC 中（吸附柱放入收罗管中）加 500μl 的均衡液 BL，12，000rpm 离心1min， 倒掉收罗管中的废液，将吸附柱再行放回收罗管中。13.2  取 1.5-4.5 毫升过夜培养的菌液 12，000rpm 离心 30sec，尽可能的倒干上清，收罗菌体。13.3  用 250μl 溶液 P1 重悬菌体千里淀，涡旋动荡至澈底悬浮。13.4  加 250μl 溶液 P2，和善地高下翻转 4 -7 次（裂解时候不逾越 5min）使菌体充分裂解。13.5  加 350μl 溶液 P3，立即和善地高下翻转 4 -7 次，充分混匀，此时会出现白色絮状千里淀，12，000rpm 离心 5 min。13.6  将上清加入到过滤柱E中（过滤柱放入 1.5ml或2ml离心管中），12，000rpm离心2 min，收罗液体。如上清量较大，请分两次离心。13.7  将上述液体转入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收罗管中），12，000rpm 离心 30-60 sec，倒掉管中的废液。 可选法子: 所用菌株为 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株时，由于核酸酶含量丰富， 应加入 500μl 去卵白液 PD，12，000rpm 离心 30-60 sec，弃废液。13.8  加入 500μl 漂洗液 WB（请先查验是否已加入无水酒精!），12，000rpm 离心 30-60 sec 弃掉废液。13.9  换取上个法子。13.10  将吸附柱 AC 放回空收罗管中，12，000rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温放弃数min，以澈底晾干吸附材料中残余的漂洗液， 以免漂洗液中残留酒精阻难卑劣反映。13.11  取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，室温放几分钟。13.12  在吸附膜的中间部位加 50μl-100μl 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事前在 65-70℃水浴中加热终端更好），室温放弃 2 min，12，000rpm 离心 1 min。如果需要较巨额质粒，可将得到的溶液再行加入离心吸附柱中，离心 1 min。(正经：若用 ddH2O 作念洗脱液，应保证其 pH 值在 7.0-8.5 规模内，pH 值低于 7.0 会诽谤洗脱效用。洗脱缓冲液体积不应少于 50 μl，体积过小影响回成效用。且 DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。)部分有关产物

货号 称号 规格 用途 abs60023 质粒小量快速索求试剂盒 50T 质粒索求试剂盒 12943 Plasmid Plus Midi Kit 25T 质粒索求试剂盒 12243 QIAfilter Plasmid Midi Kit 25T 质粒索求试剂盒

14、测序果决后的阳性克隆株进行培养，送公司测序。测序得胜的菌株进行培养和保存。

15、主张卵白的抒发主张卵白抒发时常使用E.coli Strain BL21(DE3)感受态细胞。将果决得胜后的克隆株培养之后，索求重组质粒。然后将重组质粒调换到E.coli Strain BL21(DE3)感受态细胞中。提质粒和调换可参考前文法子。15.1  包含重组质粒的E.coli Strain BL21(DE3)菌株接种到5ml包含抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养。过夜的培养基接种到500ml包含抗生素的LB培养基中，培养至OD600 =0.4–0.6。15.2  加IPTG提醒主张卵白抒发。不错对IPTG的浓度和时候进行摸索。IPTG的摸索浓度为0.05-1.0mM，提醒时候为1-5h。15.3  大肠杆菌菌体通过离心收罗（16，000g for 3 min），菌体千里淀用裂解液进行悬浮（100 μl of 50 mM Tris–HCl buffer， pH 8.0， containing 200 mM NaCl， 2% Triton X-100 and 3 mM protease inhibitor PMSF），然后冰上超声20次（sonicated 3 s with 7 s intervals between each pulse）。15.4  超声后的菌体进行离心（16，000g for 15 min at 4℃），取部分上清和6xloading buffer羼杂，在95℃加热5min。使用SDS-PAGE进行跑胶并用考马斯亮蓝 R250进行染色，检测卵白抒发是否得胜。部分有关产物

货号 称号 规格 用途 abs60105 BL21(DE3)感受态细胞 10×100ul/20×100ul 感受态细胞 abs811970 IPTG 500mg/1g/5g IPTG卵白抒发提醒 abs964 考马斯亮蓝染色试剂盒(旧例型)R250 100ml SDS-PAGE卵白电泳凝胶染色

16、卵白纯化得胜抒发盘算卵白的菌液上清可开动进行卵白纯化。标签卵白纯化时常使用2步大约3步纯化面目。 16.1 标签亲和层析凭证您构建质粒时遴荐的标签遴荐对应的标签亲和层析产物。常用的标签有HIS，GST，MBP，Strep，FLAG等等，这里以His标签预装柱和重力柱为例进行先容。（一） HisTrap HP 预装柱使用施展归拢缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 20-40mM 咪唑， PH7.4洗脱缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 500mM 咪唑， PH7.4样品上样前需要过滤，缓冲液需要预先过滤和超声去除气泡。1、 系统设备一个低流速， 移除预装柱顶部的堵头，把柱子聚会到 ӒKTA 纯化仪的接头上，慎错误液滴对液滴进行聚会，驻防引入气泡。2、 去除柱子底部的堵头，聚会到纯化仪上。3、 用 3-5 个柱体积的蒸馏水洗去酒精。4、 用 5 个柱体积的归拢缓冲液均衡柱子，淡薄流速是 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml 体积柱子）。5、 用上样环大约 superloop 加入预处理的样品（样品在上柱前一定要进行离心和过滤），在上样时淡薄流速为 0.2-1ml/min（1ml 体积柱子）和 0.5-5ml/min（5ml 体积柱子）。6、 用归拢缓冲液洗涤至少 10 到 15 个柱体积，直到招揽峰达到显露基线或在流出物中莫得物资流出。洗涤过程中淡薄保捏流速为 1-2ml/min（1ml 体积柱子）和 5-10ml/min（5ml体积柱子）。7、 用洗脱缓冲液采取一步洗脱大约线性梯度洗脱（拉咪唑浓度梯度）。一步洗脱时常 5 个柱体积，线性洗脱时常 10-20 个柱体积。在洗脱过程中保捏流速为 1-2ml/min（1ml 体积柱子）和 5-10ml/min（5ml 体积柱子）。8、 洗脱后，用 3-5 个柱体积的归拢缓冲液洗涤柱子，然后加入 20%酒精。拧上柱子高下的堵头，驻防柱子变干。Note：如果需要去除纯化后样品中的咪唑，淡薄使用 HiTrap Desalting 脱盐柱大约 PD-10 Dealting 脱盐柱。

（二） Ni Sepharose 6 FF 装重力柱使用施展归拢缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 20-40mM 咪唑， PH7.4洗脱缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 500mM 咪唑， PH7.4样品上样前需要过滤，缓冲液需要预先过滤和超声去除气泡。一、 准备 PD-10 空柱1、 用 20%的酒精洗涤滤膜。2、 用蒸馏水润洗滤膜。3、 将滤膜放入 PD-10 空柱。二、 填料准备1、 柔和轰动瓶子，直到填料悬浊液均一。2、 将需要量的填料悬浊液从瓶中周折到离心管中。3、 用 500xg 离心 5min 以千里淀填料。4、 撤回上清，加入适量蒸馏水。5、 柔和的动荡填料悬浊液 3min， 用 500xg 离心 5min。6、 撤回上清，加入适量归拢缓冲液，换取法子 5.7、 把填料悬浊液周折到量筒中。8、 加入适量体积的归拢缓冲液，使悬浊液中的填料浓度达到 50%。三、 重力柱纯化1、 将样品加入含有 50%填料的悬浊液中（样品在上柱前要进行离心和过滤）。 Ni Sepharose 6FF 的平均载量是 40mg/ml。则 1ml 的 50%悬浊液的载量为约莫 20mg 卵白。2、 将样品和填料羼杂物在摇床上低速羼杂 1h。3、 将样品和填料羼杂物加入到 PD-10 的空柱中，收罗流出物。4、 用归拢缓冲液洗涤 2-5 个柱体积，收罗流出物。5、 用 4 个柱体积的洗脱缓冲液洗脱，收罗流出物。部分有关产物

  货号 品名 规格 用途 预装柱 29051021 HisTrap HP           1 × 1 ml His标签卵白纯化 17524701 HisTrap HP            5 × 1 ml His标签卵白纯化 17524801 HisTrap HP            1 × 5 ml His标签卵白纯化 17524802 HisTrap HP            5 × 5 ml His标签卵白纯化 17531901 HisTrap FF            5 × 1 ml His标签卵白纯化 17525501 HisTrap FF            5 × 5 ml His标签卵白纯化 29048586 HisTrap excel  1 x 1 ml His标签卵白纯化 17371205 HisTrap excel           5 x 1 ml His标签卵白纯化 17371206 HisTrap excel         5 x 5 ml His标签卵白纯化 29048631 HisTrap FF Crude  1 × 1 ml His标签卵白纯化 11000458 HisTrap FF Crude  5 × 1 ml His标签卵白纯化 17528601 HisTrap FF Crude  5 × 5 ml His标签卵白纯化 填料 17526801 Ni Sepharose HP 25 ml His标签卵白纯化 17526801 Ni Sepharose HP 25 ml His标签卵白纯化 17526802 Ni Sepharose HP 100 ml His标签卵白纯化 17531806 Ni Sepharose 6 FF 5 ml His标签卵白纯化 17531801 Ni Sepharose 6 FF 25 ml His标签卵白纯化 17531802 Ni Sepharose 6 FF 100 ml His标签卵白纯化 17531803 Ni Sepharose 6 FF 500 ml His标签卵白纯化 17371201 Ni Sepharose excel 25ml His标签卵白纯化 28967390 His Mag Sepharose Ni 5x1ml His标签磁珠 28967388 His Mag Sepharose Ni 2x1 ml His标签磁珠

GST标签卵白纯化有关产物

  货号 品名 规格 用途 预装柱 17528101 GSTrap HP  5 × 1 ml GST标签卵白纯化 17528201 GSTrap HP  1 × 5 ml GST标签卵白纯化 17528202 GSTrap HP  5 × 5 ml GST标签卵白纯化 17513001 GSTrap FF  5 × 1 ml GST标签卵白纯化 17513101 GSTrap FF  1 × 5ml GST标签卵白纯化 17513102 GSTrap FF  5 × 5ml GST标签卵白纯化 29048609 GSTrap 4B  1 × 1 ml GST标签卵白纯化 28401747 GSTrap 4B  1 × 5 ml GST标签卵白纯化 填料 17527901 Glutathione Sepharose HP 25 ml GST标签卵白纯化 17527902 Glutathione Sepharose HP 100 ml GST标签卵白纯化 17513201 Glutathione Sepharose 4 FF 25 ml GST标签卵白纯化 17513202 Glutathione Sepharose 4 FF 100 ml GST标签卵白纯化 17075601 Glutathione Sepharose 4B 10 ml GST标签卵白纯化 17075605 Glutathione Sepharose 4B 100 ml GST标签卵白纯化 切除酶 27084301 PreScission Protease 500 units GST标签切除酶 27084601 Thrombin Protease 500 units GST标签切除酶

Strep标签卵白纯化有关产物

  货号 品名 规格 用途 预装柱 29401317 StrepTrap XT 1 × 1 ml Strep标签卵白纯化 29401320 StrepTrap XT 5 × 1 ml Strep标签卵白纯化 29401322 StrepTrap XT 1 × 5 ml Strep标签卵白纯化 29401323 StrepTrap XT  5 × 5 ml Strep标签卵白纯化 填料 29401324 Strep-Tactin XT Sepharose 10ml Strep标签卵白纯化 29401326 Strep-Tactin XT Sepharose 50ml Strep标签卵白纯化

MBP标签卵白纯化有关产物

  货号 品名 规格 用途 预装柱 28918779 MBPTrap HP 1 × 5 ml MBP标签卵白纯化 29048641 MBPTrap HP  1 × 1 ml MBP标签卵白纯化 28918778 MBPTrap HP  5 × 1 ml MBP标签卵白纯化 28918780 MBPTrap HP  5 × 5 ml MBP标签卵白纯化 填料 28935597 Dextrin Sepharose HP 25 mL MBP标签卵白纯化 28935598 Dextrin Sepharose HP 100 mL MBP标签卵白纯化

 

16.2 离子交换离子交换需要凭证您卵白的等电点遴荐阴离子交换柱大约阳离子交换柱。1、如果您的卵白的等电点小于缓冲液的PH，则遴荐阴离子交换柱（Q，DEAE）；2、如果您的卵白的等电点大于缓冲液的PH，则遴荐阳离子交换柱（S，SP，CM）；这里以Q柱为例进行先容。

归拢缓冲液：缓冲液的PH比盘算卵白的等电点高一个PH。保举缓冲液： 洗脱缓冲液：归拢缓冲液+1M NaCl样品上样前需要过滤，置换到归拢缓冲液中。缓冲液需要预先过滤和超声去除气泡。

1、 系统设备一个低流速， 移除预装柱顶部的堵头，把柱子聚会到 ӒKTA 纯化仪的接头上，慎错误液滴对液滴进行聚会，驻防引入气泡。2、 去除柱子底部的堵头，聚会到纯化仪上。3、 用 3-5 个柱体积的蒸馏水洗去酒精。4、 用 5 个柱体积的归拢缓冲液均衡柱子，淡薄流速是 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml 体积柱子）。5、 用上样环大约 superloop 加入预处理的样品（样品在上柱前一定要进行离心和过滤），在上样时淡薄流速为 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml 体积柱子）。6、 用归拢缓冲液洗涤至少 5个柱体积，直到招揽峰达到显露基线或在流出物中莫得物资流出。洗涤过程中淡薄保捏流速为 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml体积柱子）。7、 用洗脱缓冲液采取一步洗脱大约线性梯度洗脱（拉NaCl梯度）。一步洗脱时常 5-10 个柱体积，线性洗脱时常 10-20 个柱体积。在洗脱过程中保捏流速为 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml 体积柱子）。8、 洗脱后，使用5个柱体积归拢缓冲液+1M NaCl进行再生，然后用 5-10 个柱体积的归拢缓冲液洗涤柱子，然后加入 20%酒精。拧上柱子高下的堵头，驻防柱子变干。部分有关产物

  货号 品名 规格 用途 预装柱 28934388 HiTrap Capto IEX Selection Kit 5根不同柱子 阴、阳离子不同配基预装柱 29275878 Capto HiRes Q 5/50 5 x 50mm 高分辨率阴离子交换柱 29275881 Capto HiRes Q 10/100 10 x 100mm 高分辨率阴离子交换柱 29275877 Capto HiRes S 5/50 5 x 50mm 高分辨率阳离子交换柱 29275879 Capto HiRes s 10/100 10 x 100mm 高分辨率阳离子交换柱 29051325 HiTrap Q HP 1 × 1 ml 阴离子交换柱 17115301 HiTrap Q HP 5 × 1 ml 阴离子交换柱 17515601 HiTrap Q FF  5 × 5 ml 阴离子交换柱 11001302 HITRAP CAPTO Q， 5X1ML 5 × 1 ml 阴离子交换柱 11001303 HiTrap Capto Q  5 × 5 ml 阴离子交换柱 29051324 HiTrap SP HP 1 × 1 ml 阳离子交换柱 17115101 HiTrap SP HP 5 × 1 ml 阳离子交换柱 17115201 HiTrap SP HP 5 × 5 ml 阳离子交换柱 17505401 HiTrap SP FF 5 × 1 ml 阳离子交换柱 17515701 HiTrap SP FF  5 × 5 ml 阳离子交换柱 17544122 HITRAP CAPTO S， 5X1 ML 5 × 1 ml 阳离子交换柱 17544123 HiTrap Capto S 5 × 5 ml 阳离子交换柱 17505501 HiTrap DEAE FF  5 × 1 ml 弱阴离子交换柱 17515401 HiTrap DEAE FF  5 × 5 ml 弱阴离子交换柱 28916537 HiTrap Capto DEAE， 5X1ML 5 × 1 ml 弱阴离子交换柱 28916540 HiTrap Capto DEAE 5 × 5 ml 弱阴离子交换柱 17515501 HiTrap CM FF  5 × 5 ml 弱阳离子交换柱 28405846 HiTrap Capto adhere  5 × 5 ml 阴离子交换柱 填料 17531610 CAPTO Q， 25 ML 25 ml 阴离子交换填料 17531602 Capto Q 100 ml 100 ml 阴离子交换填料 17051010 Q Sepharose FF 25 ml 阴离子交换填料 17051001 Q Sepharose FF 300 ml 阴离子交换填料 17544110 CAPTO S， 25 ML 25 ml 阳离子交换填料 17544101 CAPTO S， 100 ML 100 ml 阳离子交换填料 17072910 SP Sepharose FF 25 ml 阳离子交换填料 17072901 SP Sepharose FF 300 ml 阳离子交换填料 17544301 CAPTO DEAE， 100 ML 100 ml 阴离子交换填料 17070910 DEAE Sepharose FF 25 ml 阴离子交换填料 17070901 DEAE Sepharose FF 500 ml 阴离子交换填料 17071910 CM Sepharose FF 25 ml 阳离子交换填料 17071901 CM Sepharose FF 500 ml 阳离子交换填料 17544410 Capto adhere 25 ml 多模式填料

16.3  凝胶过滤层析凝胶过滤层析主要用于邃密纯化大约去除多聚体。凝胶过滤层析主要凭证上样量和卵白分子量进行遴荐。这里以Superdex 200 Increase 10/300为例进行先容。

缓冲液的遴荐：缓冲液不错凭证您的样品大约卑劣诈骗进行遴荐，由于在极低盐浓度的情况下，酸性和碱性卵白质都可能发生离子相互作用，因此保举的缓冲液是 0.01 至 0.05 M 磷酸钠再加上0.15 M NaCl，pH 7.4。

样品处理：分子量：10KD-600KD上样体积：25-500ul卵白浓度：样品中最多50 mg/mL，在低于10 mg/mL时可取得更高的分辨率。准备：将样品溶解在缓冲液中，10 000 g 离心10 分钟，用0.22 μm 过滤器过滤。

1、凭证层析柱的耐压在系统中设备柱前压和delta压2、系统设备一个低流速， 移除预装柱顶部的堵头，把柱子聚会到 ӒKTA 纯化仪的接头上，慎错误液滴对液滴进行聚会，驻防引入气泡。3、去除柱子底部的堵头，聚会到纯化仪上。4、以0.75 mL/min 的流速使用至少 2 个柱体积 (CV) 的室温去离子水进行均衡。5、以0.75 mL/min 的流速用至少 2 个柱体积 (CV) 缓冲液均衡层析柱。6、以0.75 mL/min 的流速进行上样温存冲液洗脱。7、纯化完毕后，用2CV的去离子水清洗柱子，然后填充20%酒精。拧上柱子高下的堵头，驻防柱子变干。部分有关产物

  货号 品名 规格 用途 预装柱 29219757 Superdex 30 Increase 10/300 GL 10 x 300 mm 凝胶过滤0-7KDa 29148721 Superdex 75 Increase 10/300 GL 10 x 300 mm 凝胶过滤 3-70 KDa 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL 10 x 300 mm 凝胶过滤 10 -600 KDa 28990945 Superdex 200 Increase 5/150 GL 5 x 150 mm 凝胶过滤 10 -600 KDa 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL 10 x 300 mm 凝胶过滤 5-5000KDa 28989333 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 16 x 600 mm 凝胶过滤 3-70 KDa 28989334 HiLoad 26/600 Superdex 75 pg 26 x 600 mm 凝胶过滤 3-70 KDa 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 16 x 600 mm 凝胶过滤 10 -600 KDa 28989336 HiLoad 26/600 Superdex 200 pg 26 x 600 mm 凝胶过滤 10 -600 KDa 17090501 SUPERDEX 30 PREP GRADE 150 ML 150ml 凝胶过滤0-7KDa 17104401 SUPERDEX 75 PREP GRADE 150 ML 150ml 凝胶过滤 3-70 KDa 17104301 SUPERDEX 200 PREP GRADE 150 ML 150ml 凝胶过滤 10 -600 KDa 填料 17059901 Sephacryl S-300 HR 750ml Sephacryl 凝胶填料 17058410 Sephacryl S-200 HR 150ml Sephacryl 凝胶填料 17003301 Sephadex G-25 Medium 100 g Sephacryl 凝胶填料 17003302 Sephadex G-25 Medium 500 g Sephacryl 凝胶填料 17004301 Sephadex G-50 Medium 100 g Sephacryl 凝胶填料 分子筛Marker 17036001 Blue Dextran 2000 10g 10g 详情凝胶柱中的闲隙体积

17、跑胶果决纯化后的卵白大小和纯度果决可用SDS-PAGE跑胶进行果决。17.1 配胶：拿出电泳仪的制胶架，干净的玻璃板，夹紧玻璃板。先配制基层的分离胶。用烧杯大约锥形瓶按照以下配方进行配制。   

摇匀，用移液枪妥贴加入玻璃板中，正经尽量不要产不悦泡。用1ml无水酒精大约蒸馏水，压在分离胶上头。待分离胶凝固后，倒出表层的无水酒精大约水，用滤纸吸干。按照以下配方配制表层浓缩胶。 摇匀，用移液枪妥贴加入玻璃板中，正经尽量不要产不悦泡。插入梳子。17.2 上样把制备好的凝胶从制胶架上取下来，放入电泳槽中。电泳槽加入电泳缓冲液。取部分样品和6xloading buffer羼杂，在95℃加热5min。拔出胶上的梳子，把样品加到梳孔中。在附近的孔中加上卵白Marker。电泳缓冲液配方： 17.3 跑胶盖上电泳仪盖子，插上电源。不错先用80V跑胶，当样品跑入分离胶后，可用220V跑胶。溴酚蓝跑到相比靠下的位置，住手跑胶。17.4 染色可用考马斯亮蓝R250进行凝胶染色。这里以爱必信的考马斯亮蓝R250产物施展进行先容。（1）电泳完毕后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液不错充分掩盖凝胶。（2）置于水平摇床或侧摆摇床上妥贴摇动，室温染色 1h 或更永劫候。注：具体的染色时候取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时候宜顺应延迟。凝胶较薄，温度较高，则染色时候不错顺应镌汰。时常染色至凝胶的样子和染色液的样子终点接近，在染色液中险些看不清凝胶时，不错以为已染色充分。（3）倒出染色液。染色液不错回收换取使用至少 2-3 次。（4）加入适量考马斯亮蓝染色销毁液，确保销毁液不错充分掩盖凝胶。（5）置于水平摇床或侧摆摇床上妥贴摇动，室温销毁 4-24h。时间更换销毁液 2-4 次，直至蓝色配景基本上全部被脱去，况兼卵白条带染色终端达到预期。时常卵白条带在销毁 1-2h 后即可出现。注：销毁时候过长也会导致卵白条带的样子变浅。（6）完成销毁后，进行不雅察和拍照。

 

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